En
definitiva, el final de la evaluación completa del
patrón de difracción de un cristal significa
haber
obtenido una descripción completa de su red
recíproca (geometría + intensidades), y de
ahí el conocimiento de la red directa:
celdilla
unidad (
a,
b,
c,
α,
β,
γ),
tipo
de red (primitiva o centrada) y
simetria
cristalina (grupo
espacial), es decir, todos los ingredientes para poder abordar la
resolución de la estructura interna del cristal.
En
general, lo expuesto hasta aquí es suficiente para
comprender cuáles han sido, y son, los procedimientos
experimentales para evaluar el patrón de
difracción, es
decir, el conjunto de intensidades y geometría de
distribución de los máximos de Bragg. Por lo
tanto, desde
aquí el lector podría volver
al
punto de partida.
Sin embargo, el lector avanzado debería echar un vistazo a
los siguientes apartados...
¿Cuántos
cristales se
necesitan y a qué temperatura se realiza la
difracción?
Como es obvio, los primeros
experimentos
de
difracción se realizaban sobre materiales cristalinos
estables, como los minerales o los compuestos inorgánicos,
que
dificilmente se dañan con la radiación, por lo
que bastaba uno o dos
cristales para poder llevar a cabo el experimento de la
difracción.
Sin
embargo, con el paso del tiempo, los cristalógrafos
comenzaron a
ocuparse de resolver problemas estructurales derivados de sustancias
cada vez más complejas y lábiles que, debido al
rápido deterioro que
provoca la radiación, requerían del uso de
múltiples cristales. Tal
como se mostró en un apartado anterior, esta necesidad trajo
consigo la
aparición de la crio-cristalografía,
es decir la adaptación de un mecanismo para el enfriamiento
del cristal
durante su exposición a los rayos X, consiguiendo con ello
una mayor
estabilidad del cristal frente al daño que normalmente
provoca la
radiación X.
Cristal
crio-protegido en una matriz anti-congelante (izquierda),
montado frente a una corriente de
nitrógeno líquido evaporado a unos 100
K (derecha)
Este procedimiento,
todavía en
uso en la mayor parte de
los experimentos de difracción en los laboratorios
cristalográficos o
en instalaciones de sincrotrón, necesitó del
desarrollo de una técnica
para el montaje de los cristales mediante pequeños
lazos que
sirven para "pescar" el cristal en una
matriz
que sea transparente a los rayos X, consistente en un crio-protector
(anti-congelante). Este procedimiento es especialmente importante en
el caso de los cristales de proteína, en los que dicha
matriz crio-protectora se dispersa por los canales
interiores del cristal y reemplaza las moléculas de agua,
pues de no
hacerse de este modo, la
congelación del agua interna provocaría la
ruptura del cristal. Mediante esta técnica, y
también gracias a la alta
potencia de las fuentes de radiación sincrotrón,
se ha reducido mucho
el número de cristales necesarios para realizar un
experimento de difracción completo, especialmente en el caso
de las
proteínas, que suelen presentar cristales muy
lábiles frente a la
radiación y a la temperatura.
Sin embargo, con la aparición de las últimas
generaciones de radiación sincrotrón
y/o XFEL, se está imponiendo
la denominada cristalografía de milisegundos
en serie (Nature
Communications (2017) 8, art. 542). Esta
técnica se realiza en una línea de
sincrotrón equipada con un inyector de alta viscosidad que
deposita microcristales sobre una rejilla, y un detector de
área de alta sensibilidad y velocidad, permite que los
típicos experimentos cristalográficos se puedan
realizar a temperatura ambiente. Usando un mecanismo de enfoque sobre
cada microcristal individual, se pueden almacenar cientos, miles, de
patrones de difracción parciales (pues el cristal apenas se
puede girar) que convenientemente unificados y escalados dan lugar a un
patrón de difracción completo con el que abordar
la resolución estructural por el procedimiento que
corresponda. En comparación con los datos en serie recogidos
en un láser de electrones libres (XFEL), los datos del sincrotrón
son de menor resolución, pero se necesitan menos patrones de
difracción para la resolución “de
novo” de las fases. En general, los datos que recopilamos
mediante cristalografía en serie a temperatura ambiente son
de calidad comparable a los datos crio-cristalográficos y se
pueden recolectar rutinariamente en los sincrotrones.
¿Hay
algo más que los máximos de Bragg?
La aparición de las nuevas y potentes fuentes de
radiación (sincrotrón
+ XFEL)
ha dado lugar a la
consideración de cierta información existente en
el
patrón de difracción que no se estaba tomando en
cuenta con anterioridad. Nos referimos a la denominada
difracción continua, es decir a la distribución
de intensidad, poco definida, que puede aparecer alrededor y entre los
denominados máximos de Bragg, así como en las
zonas de mayor ángulo de Bragg, en donde los
máximos definidos casi han desaparecido.
Este
fenómeno es prácticamente despreciable en los
cristales de composición relativamente sencilla en donde
predomina el
estricto orden cristalino y la homogeneidad de las
moléculas que lo forman. Sin embargo, se ha demostrado [Nature
(2016) 530, 202-206]
que esta información puede ser muy relevante en el
caso de las macromoléculas biológicas, en donde
la nitidez de los máximos de Bragg puede decrecer
rápidamente en función del ángulo de
difracción (ver patrón de difracción
en la figura de la derecha).
Aunque la
explicación de estos hechos
sobrepasa la intención
de estas páginas, hemos considerado relevante
añadir una mínima
explicación sobre este fenómeno y la importancia
de su consideración en
el mundo de la cristalografía biológica.
La idea que
subyace en el artículo mencionado es
que en los cristales de macromoléculas
biológicas, además de la posible
incidencia de una posible heterogeneidad molecular, lo más
importante para
explicar la drástica desaparición de
máximos de Bragg en función del ángulo
de difracción es la ausencia de
orden estricto en las posiciones u orientaciones moleculares, lo cual
conduce a una
pérdida de homogeneidad en el retículo
cristalino.
Los
desplazamientos de las moléculas de sus posiciones ideales
en la red cristalográfica, dan lugar a un patrón
de difracción continua, que se explica por la suma
incoherente de la difracción que procede de complejos
moleculares individuales, rígidos, alineados a lo largo de
varias orientaciones cristalográficas discretas.
Patrón de
difracción de una macromolécula
biológica en donde se observa la rápida
disminución de la intensidad de las manchas
nítidas (máximos de Bragg), y la
aparcición de zonas amplias de ennegrecimiento, con bordes
indefinidos. Imagen tomada de Nature
(2016) 530, 202-206.
Aunque la
existencia de la difracción continua ya era
conocida, y ha sido usada especialmente para interpretar los
fenómenos
dinámicos de las proteínas, el artículo
mencionado más arriba aporta
novedades importantes para la determinación de la estructura
de las macromoléculas biológicas a partir del
fenómeno de la difracción por los cristales.
La consideración de la difracción continua
implica que la intensidad en cada punto del patrón de
difracción está constituida por dos
términos: uno representando la difracción
coherente
de Bragg, y el otro la difracción continua, incoherente. La
diferencia entre ambos términos es que cada uno de ellos
está modulado por distintas combinaciones de aspectos
estructurales. La difracción continua está
determinada por la suma incoherente de las intensidades producidas por
cada unidad asimétrica, es decir, por cada
molécula o conjunto de átomos que, en principio,
se repite por las operaciones de simetría en el interior de
la celdilla elemental. Sin embargo, la difracción de Bragg
tiene su origen en la suma coherente de la difracción
producida por la repetición de las celdillas elementales
(ver esquema de la derecha).
Estas consideraciones
implican aportaciones muy relevantes para la determinación
estructural de las macromoléculas,
y no sólo para aumentar el conocimiento de los detalles
moleculares (grado
de resolución del modelo), sino como
herramienta para asignar fases a
las intensidades de
difracción.
Esquema
mostrando la causa de la aparición de la
difracción
contínua frente a la difracción coherente
