13.  La revolución de los XFEL
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Capítulo escrito por José M. Martín García.

Le animamos a leer el contenido del presente capítulo, en donde encontrará respuestas sobre los siguientes aspectos:


¿Qué es un XFEL?
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FEL es el acrónimo de "Free Electron Laser", es decir, láseres de electrones libres. Los FEL existen desde hace más de 50 años, desde que fueron introducidos por John Madey a principios de la década de 1970. Los primeros FEL operaban en las longitudes de onda de los infrarrojos, visible y ultravioleta. El primer FEL que funcionó en el ámbito de los rayos X (concretamente en la región de los rayos X blandos) lo hizo en el centro DESY (Deutsches Elektronen-Synchrotron), y se denominó FLASH (acrónimo de Free-electron LASer in Hamburg), comenzando a funcionar en 2005.  Poco después, en 2009, apareció en Estados Unidos el primer FEL que ya operaba con rayos X duros (XFEL), el denominado LCLS (acrónimo de Linac Coherent Light Source) en el SLAC (Stanford Linear Acelerator Center). Desde entonces se han construido cuatro XFEL más (SACLA en Japón, EuXFEL en Alemania, PAL-XFEL en Corea del Sur, y SwissFEL en Suiza), dos más están actualmente en construcción (LCLS-II en Estados Unidos, y SHINE en China), y ya se planea la construcción de otro más (UK-XFEL en el Reino Unido).

Los XFEL (X-ray Free-Electron Lasers) son grandes equipamientos de investigación de varios Km de longitud (unos 3 Km) capaces de generar de forma rutinaria pulsos laser coherentes, en el rango de los rayos X, ultra brillantes, sintonizables, y de cortísima duración. En los próximos párrafos presentamos algunos de los más relevantes del mundo:
   

Linac Coherent Light Source (LCLS, Estados Unidos) La instalación de LCLS está ubicada en el Laboratorio Nacional SLAC en Menlo Park, California (Estados Unidos). LCLS fue el primer láser del mundo, y uno de los cinco que están en funcionamiento produciendo rayos X "duros" o de muy alta energía. Actualmente, el LCLS emite 120 pulsos de rayos X por segundo, cada uno con una duración del orden de los femtosegundos. Desde que comenzó a funcionar en 2009, el LCLS cuenta con más de 3.000 usuarios, se han realizado más de 9.000 experimentos en sus siete instrumentos (TMO, ChemRIXS, XPP, XCS, FMX, CXI y MEC), y se han publicado más de 1.450 artículos de investigación.
 
Desde hace varios años, se está llevando a cabo una importante mejora de esta instalación, conocida como LCLS-II. Esto proporcionará un salto revolucionario en capacidad, al aumentar la frecuencia de repetición de pulsos de rayos X de 120 pulsos por segundo a 1 millón de pulsos por segundo. LCLS-II será una herramienta transformadora para la ciencia sobre la energía, que cambiará cualitativamente la forma en que las imágenes de rayos X, en sus formas de dispersión y de espectroscopia se pueden utilizar para estudiar cómo funcionan los sistemas naturales y artificiales. Permitirá nuevas formas de capturar y visualizar procesos químicos, estudiar materiales cuánticos con una resolución sin precedentes, y rastrear el comportamiento de los sistemas biológicos fluctuantes.
 

LCLS -aerial
Linac Coherent Light Source (LCLS, Estados Unidos)


SPring-8 Angstrom Compact free electron LAser (SACLA, Japón)

SACLA es un láser de electrones libres de rayos X ubicado en la ciudad de Harima Science Garden en Japón. Está integrado en el complejo del sincrotrón y acelerador Spring-8. Entró en funcionamiento en 2011, siendo el segundo XFEL del mundo después de LCLS. Es una instalación de 700 m de largo que produce pulsos de rayos X brillantes con una frecuencia de repetición entre 30 y 60 pulsos por segundo. SACLA tiene tres líneas de luz, dos de ellas que producen rayos X “duros” (BL2 y BL3) y una que produce rayos X “blandos” (BL1).
SACLA, Japan
SPring-8 Angstrom Compact free electron LAser (SACLA, Japón)
 

European XFEL (Eu-XFEL) El XFEL europeo (EuXFEL) es actualmente la instalación XFEL más grande del mundo (3,4 Km). Se extiende desde el campus de DESY en Hamburgo hasta la ciudad de Schenefeld en Schleswig-Holstein. Su construcción se inició a principios de 2009 y el acceso a usuarios comenzó en septiembre de 2017. El EuXFEL se ha realizado gracias al gran esfuerzo de 12 países socios: Dinamarca, Francia, Alemania, Hungría, Italia, Polonia, Rusia, Eslovaquia, España, Suecia, Suiza y el Reino Unido. Genera 27.000 destellos de rayos X ultracortos por segundo, y con un brillo mil millones de veces superior al de las mejores fuentes de radiación de rayos X convencionales, los sincrotrones. Además, tiene una estructura de pulsos única en la que los pulsos, en el rango de los femtosegundos, se producen en forma de “trenes” con un espaciado de  100 ms entre los diferentes “trenes”.
 

EU-XFEL, 3,4 Km long
El XFEL europeo
La instalación de 3,4 kilómetros de largo se extiende desde el campus de DESY en Hamburgo hasta la ciudad de Schenefeld en Schleswig-Holstein.


Pohang Accelerator Laboratory (PAL-XFEL, Corea del Sur) El láser de electrones libres de rayos X del laboratorio del acelerador de Pohang (PAL-XFEL) se encuentra en la ciudad de Pohang, en Corea del Sur. Está operativo desde 2017, siendo el tercer XFEL que entró en funcionamiento. PAL-XFEL consta de una línea FEL de rayos X duros (HX) y otra de rayos X blandos (SX). La línea HX incluye un túnel de aceleración de los electrones de 780 m de longitud, un túnel de ondulación de 250 m de longitud, y salas experimentales de 80 m de longitud. La línea SX se bifurca a 260 m del inicio e incluye una túnel de aceleración de los electrones de 170 m de longitud, una túnel de ondulación de 130 m de longitud, y una sala experimental de 30 m de longitud. La línea HX genera un haz de luz FEL entre 2 y 15 keV, con pulsos de entre 10 y 35 fs de duración. La línea SX genera un haz de luz FEL entre 0.25 y 1.25 keV a partir de haces de electrones con más de 1012 fotones de 3 GeV.
 
 
PAL-XFEL
Pohang Accelerator Laboratory (PAL-XFEL, Corea del Sur)
 

Switzerland Free Electron Laser (SwissFEL, Suiza) El SwissFEL es un láser de rayos X de electrones libres de 740 m de longitud perteneciente al Instituto Paul Scherrer (PSI) (Villigen, Suiza), que fue inaugurado en diciembre de 2016. El diseño de SwissFEL está optimizado para generar pulsos de rayos X en el rango de longitud de onda de 1 a 70 Å. Los trabajos de construcción de SwissFEL comenzaron en la primavera de 2013. Una vez finalizado el edificio, la instalación de los componentes técnicos comenzó a principios de 2015. El coste total de la construcción es de alrededor de 275 millones de francos suizos. Los primeros experimentos piloto se llevaron a cabo en 2017. En 2018 se puso en funcionamiento la primera línea de luz FEL, ARAMIS. Se espera que la segunda línea de luz FEL, ATHOS, lo haga en 2021. ARAMIS genera rayos X de onda corta y de muy alta energía, que puede usarse para seguir cómo se comportan los átomos durante procesos de movimiento rápido. ATHOS proporciona una luz de rayos X más blandos, con menor energía, lo que permite observar átomos y moléculas durante la formación de los enlaces químicos.


SwissFEL
Switzerland Free Electron Laser (SwissFEL, Suiza)
  
 
En los XFEL, los grupos de electrones que se generan mediante un cañón de electrones se aceleran a la velocidad de la luz en un acelerador lineal de unos pocos kilómetros, justo antes de alcanzar los llamados onduladores. Una vez allí, los electrones se mueven a través de potentes imanes, lo que permite que los electrones interactúen con la radiación X que ellos mismos emiten, lo que provoca un microaglomerado de electrones con un espaciado igual a la longitud de onda de los rayos X emitidos. A medida que los electrones avanzan a través de los onduladores, su emisión se vuelve cada vez más coherente, lo que conduce a pulsos altamente coherentes con una duración de femtosegundos. El número extremadamente alto de electrones de cada microaglomerado (del orden de mil millones), la alta coherencia longitudinal, y la duración ultracorta de los pulsos, convierte a los XFEL en las fuentes de rayos X más potentes del mundo, con un brillo máximo 10 órdenes de magnitud más alto que el que se puede lograr actualmente en los sincrotrones.


Undulator EUxfel
Sala de onduladores en el EuXFEL (Foto: EuXFEL)


Undulator scheme
Representación esquemática de un segmento de un ondulador en una instalación XFEL 
Figura tomada de Martin-Garcia et al., ABB (2016)
 
La figura de arriba muestra un haz de electrones relativista (línea continua) que previamente, antes de la interacción con el ondulador, se acelera y lleva a altas energías mediante un acelerador lineal (no representado en la imagen). Estos electrones viajan en forma sinusoidal, inducida por la disposición especial de los imanes dentro ondulador, constituida por una matriz periódica de dipolos magnéticos (representados como cajas rojas y azules). Debido a que los electrones se mueven en trayectorias curvas a través de los imanes, el cambio en su momento provoca la emisión de radiación monocromática (representada como un cono rojo), de la misma manera que lo hace un sincrotrón.


Undulator
 Animación ilustrando el movimiento ondulante de los grupos de electrones que pasan a través del ondulador
 

Brightness
Comparación del brillo máximo en función de la energía de los fotones. Se comparan láseres convencionales, fuentes de radiación de sincrotrón, y láseres de electrones libres de rayos X (XFEL). Figura tomada de Boutet and Yabashi, in X-ray Free Electron Lasers, Springer (2018)

Los lectores interesados pueden observar el video realizado por SLAC (Stanford Linear Accelerator Center), explicando cómo funciona un XFEL.
 

Cristalografía en serie a escala de femtosegundos (Serial Femtosecond Crystallography, SFX)
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Los XFEL han marcado el comienzo de una nueva era de la ciencia de los rayos X. De hecho, las propiedades únicas de los XFEL (alto brillo y corta duración de pulso) han facilitado la aparición de un nuevo avance científico-tecnológico en el campo de la biología estructural, la cristalografía en serie a escala de femtosegundos (Serial Femtosecond Crystallography, SFX).

SFX se basa en el principio conocido como "difracción antes de la destrucción", mediante el cual los eventos de dispersión de fotones por los cristales cuando son golpeados por pulsos XFEL ocurren tan rápido que la difracción de los cristales puede registrarse antes de que éstos sean destruidos.
Explosion of T4 lysozime
Explosión de lisozima T4 (blanco: H; gris: C; azul: N; rojo: O; amarillo: S) cuando se expone a un pulso FEL de rayos X con un FWHM de 2 fs, y su posterior desintegración. Las posiciones atómicas en las dos primeras estructuras (antes y después del pulso) son prácticamente idénticas a esta longitud de pulso inducida por el XFEL. Figura tomada de Neutze et al. Nature (2000)


En SFX, los datos de difracción ya no se obtienen de cristales individuales crioenfriados y montados en un goniómetro, tal como se realiza en la cristalografía convencional. En su lugar, cientos de miles de nanocristales o microcristales se inyectan en serie al haz de XFEL, en orientaciones aleatorias, y a temperatura ambiente, de modo que solo se registra una instantánea por cada cristal y cada pulso de rayos X. Debido a que el rayo XFEL es muy intenso, los cristales deben reponerse constantemente entre pulsos de rayos X, ya que los cristales son, literalmente, destruidos después de cada disparo.

En las secciones que se muestran a continuación se pueden encontrar muchos más aspectos experimentales de esta nueva forma de hacer cristalografía.


experimental setup
Representación esquemática de la configuración experimental de un experimento SFX típico en un XFEL. Los nanocristales (puntos verdes) orientados aleatoriamente en sus aguas madres se inyectan al foco del haz de rayos X mediante un inyector de líquido. El haz de rayos X, transversal al chorro del inyector, golpea los cristales en la región de interacción y los patrones de difracción de los monocristales se registran en un detector. Figura tomada de Martin-Garcia et al., ABB (2016)


Desde que se determinó la primera estructura cristalina de una proteína en un XFEL, y hasta la fecha 2 de octubre de 2021, se han depositado en el PDB más de 466 estructuras determinadas mediante esta tecnología.

Debido a que los experimentos de SFX se realizan a temperatura ambiente, no solo es posible la determinación de estructuras cristalinas estáticas, sino que también es posible hacer estudios con resolución temporal para determinar la estructura cristalina de estados intermedios en reacciones enzimáticas, lo que nos permite comprender la dinámica conformacional de procesos biológica en escalas de tiempo que van desde los 100 fs hasta unos pocos minutos.

Además, la corta duración de los pulsos producidos por los XFEL permite a SFX superar la principal limitación de la cristalografía macromolecular con los sincrotrones: el daño por radiación. Por lo tanto, SFX permite el estudio de macromoléculas en condiciones "nativas", es decir a temperatura ambiente y en sus aguas madres.
 


SFX para determinar la estructura de las macromoléculas
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La posibilidad de obtener datos de difracción de rayos X casi sin ocasionar daños a las macromoléculas, ha tenido un gran impacto en dos áreas de investigación de la biología estructural:
 
  1. Cristalografía in vivo: El crecimiento espontáneo de cristales de proteínas dentro de células vivas, que se conoce desde hace mucho tiempo y que se ha observado en una gran variedad de organismos vivos, desempeña una gran variedad de funciones desde el almacenamiento de alimentos hasta la defensa, además de ser identificado en algunas patologías humanas [Dogan et al., Head & Neck Pathology (2012),  Doye & Poon, COCIS (2006), Lange et al., Cell & Tissue Res. (1982) , Pande et al., PNAS (2001)].
Los avances recientes en los sistemas de expresión de proteínas, especialmente en las líneas celulares de insectos infectadas con baculovirus, han convertido la cristalización in vivo en una alternativa interesante y plausible para poder cristalizar proteínas recombinantes que no pueden cristalizarse mediante métodos convencionales in vitro.
micrographs
(a) Microfotografía de células de insecto Sf9 mostrando cristales en forma de agujas de la proteína CatB en su interior. (b) Microfotografía EM de barrido de un grupo de células Sf9 mostrando cristales que atraviesan la membrana celular. (c) Microfotografía TEM de una célula de insecto Sf9 seccionada, con cristales en su interior. (d) Microfotografía TEM de la sección de una célula de insecto Sf9, mostrando el corte perpendicular al eje largo de un cristal. (e) Micrografía TEM mostrando la estructura reticular de un cristal. Figuras tomadas de Koopmann, R. et al., Nat Methods (2012)

 
 crystals growing inside cell
Gif animado que muestra un microcristal de proteína luciferasa que crece dentro de una célula de insecto
Vídeo original tomado de Koopmann, R. et al., Nat Methods (2012)

Los cristales cultivados in vivo tienen dos limitaciones principales por las cuales no son adecuados para estudios de rayos X en fuentes de luz de sincrotrón: a) tienden a ser muy sensibles al daño por radiación, y b) se ha demostrado que su tamaño es demasiado pequeño (unas pocas micras), estando típicamente restringido al tamaño de las células. La aparición de los XFEL y el establecimiento de la técnica SFX (cristalografía en serie a escala de femtosegundos) han abierto nuevas vías en el análisis estructural, utilizando cristales cultivados in vivo para determinar las estructuras cristalinas de proteínas. Hasta la fecha, esta nueva metodología ha determinado un total de 14 estructuras.
  1. Receptores acoplados a proteínas G (GPCR): Los GPCRs pertenecen a una gran familia de receptores celulares implicados en algunas de las patologías humanas más crónicas, como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares, la diabetes, la obesidad y los trastornos inmunitarios; siendo, probablemente, la familia de proteínas diana más atractiva para el descubrimiento de fármacos basado en la estructura. Sin embargo, la obtención de datos de difracción de alta calidad en sincrotrones a partir de cristales grandes se ha convertido en un gran desafío. La cristalización de los GPCRs normalmente conduce a la formación de cristales de tamaño micrométrico, lo que los hace adecuados para experimentos SFX. De hecho, SFX (junto con Cryo-EM) ha contribuido notablemente al rápido crecimiento de los estudios estructurales de los GPCRs en los últimos 10 años. Hasta mayo de 2020, se han determinado un total de 13 estructuras mediante SFX desde que la primera estructura salió publicada en 2013 para el receptor de serotonina 5-HT2B.  
GPCRs structures
Cronología de las estructuras de GPCRs en XFEL hasta mayo de 2020
Figura tomada de Fromme et al., eLS (2020)

 Dinámica estructural y películas moleculares con XFEL
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Además de determinar estructuras estáticas de macromoléculas, la metodología SFX con los XFEL ofrece la posibilidad de capturar dinámicas estructurales.

La naturaleza porosa de los cristales macromoleculares, con grandes canales acuosos que permiten que los ligandos difundan en su interior, junto con el pequeño tamaño de los cristales utilizados en SFX (en el rango de nanómetros o micrómetros), hacen que esta metodología sea ideal para experimentos de resolución temporal ("Time Resolved SFX", TR -SFX). El tamaño diminuto de los cristales usados en SFX permite que un mayor porcentaje de moléculas de proteína en su interior, se activen rápida y uniformemente mediante un láser o una mezcla rápida.


porous nature of macromolecular crystals
Ilustración de la naturaleza porosa de los cristales macromoleculares. La figura del medio muestra cómo las moléculas de proteína de la oxidorreductasa humana NQO1 (PDB 5FUQ) se encuentran organizadas dentro de un cristal real tridimensional. Las figuras de la izquierda y de la derecha muestran el mismo empaquetamiento cristalino de las moléculas de NQO1, visto desde los otros dos lados del cristal, mostrando los huecos por los que pueden difundir los ligandos


Para que un experimento resuelto en el tiempo tenga éxito, el inicio de la reacción enzimática debe producirse de forma rápida y homogénea, y esto solo se puede lograr utilizando cristales muy pequeños.. Un estudio realizado por Marius Schmidt en 2013 demuestra que el pequeño tamaño de los cristales utilizados en SFX, teóricamente permiten tiempos de difusión en la escala de los microsegundos, lo que permite la posibilidad de estudiar muchas reacciones enzimáticas que ocurren en tiempos de milisegundos o incluso de microsegundos. Por ejemplo, se ha estimado que el tiempo de difusión de un ligando dentro de un cristal con dimensiones de 0,5 x 0,5 x 0,5 µm3 sería de 17 µs, mientras que en un cristal de 3 x 4 x 5 µm3 se estima en 1 ms, y en uno  de 300 x 400 x 500 µm3 sería de 9,5 s.

Existen dos tipos de experimentos TR-SFX que se pueden realizar en los XFEL: 1) experimentos TR-SFX del tipo “pump-probe”, en los que los cristales inyectados, son iluminados por un láser, y, después de un cierto tiempo predeterminado (tiempo de retardo), son analizados por los rayos X, y 2) experimentos de mezcla e inyección rápida, en los que los microcristales de proteína se mezclan con un ligando para que éste difunda rápidamente en el interior de los cristales y se una a las moléculas de proteína.


schematic setup
Configuraciones esquemáticas típicas de experimentos TR-SFX en los XFEL. (a) Configuración de un experimento de mezcla e inyección rápidas en el que los microcristales de proteína se mezclan con un ligando en la región de interacción del inyector (marco negro), de modo que el ligando difunda rápidamente en el interior de los cristales y se una a las moléculas de proteínas (marco rojo). Los retardos de tiempo se controlan variando la velocidad de flujo de la muestra y del búfer, o mediante el uso de capilares más largos colocados después de la cámara de mezcla. (b) Configuración de un experimento del tipo “pump-probe”, en el que los cristales son inyectados e iluminados por un láser antes de ser analizados por los rayos X, después de un tiempo de retardo predeterminado (Δt). Figura tomada de Fromme et al., eLS (2020)


En ambos escenarios, es posible estudiar no solo los estados inicial y final de una reacción bioquímica, sino también los estados intermedios, que son extremadamente rápidos y se forman a medida que avanza la reacción. De este modo, al poder resolver las estructuras de todos los estados intermedios que se forman a lo largo de una reacción bioquímica, se puede obtener una "película molecular" que revela el modo en el que las moléculas biológicas se comportan en el interior de nuestras células.

Desde que se llevara a cabo el primer experimento TR-SFX en un XFEL, para estudiar la reacción irreversible de desacoplamiento de ferredoxina reducida del Fotosistema I (PSI) mediante un experimento de “pump-probe” [Aquila et al., Opt. Ex. (2012)], se han dilucidado, parcial o totalmente, con éxito varios mecanismos de reacción.
 
 
Ejemplos de experimentos TR-SFX con proteínas activadas por luz en XFEL

PYP photocycle

Isomerización de trans (rosa) a cis (verde) en PYP entre 100 fs y 3 ps. La región resaltada en gris no fue explorada. La línea discontinua muestra el momento de la transición, el cual se produce aproximadamente a 590 fs. Los paneles interiores muestran los mapas de densidad electrónica diferencia [en rojo (−3σ) y azul (3σ)] de las estructuras de PYPtrans (rosa), PYPcis (verde claro) y la estructura en estado oscuro PYPref (círculo amarillo). Figura tomada de  Pande et al., Science (2016)



PYP
Animación del proceso de isomerización en PYP
La película original se puede obtener desde este enlace

bR
Ciclo de isomerización de la molécula de bacteriorodopsina
La correspondiente película molecular puede observarse desde este enlace
 
 
 Ejemplos de experimentos TR-SFX mediante mezcla y difusión rápida de ligandos en XFEL
BlaC
Arriba. Descripción general de BlaC 500 ms después de mezclar con CEF. Los mapas de omisión ("omit-maps"=mapas de densidad electrónica calculados tras la exclusión de átomos cuestionados) se muestran en verde para el estado intermedio E-CFO* unido covalentemente. En verde oscuro se muestra la densidad electrónica de una molécula de ceftriaxona adicional, apilada cerca del sitio activo. Figure adaptada de Olmos et al., BMC Biol. (2018)
Abajo. "Omit maps" de las estructuras del sitio activo (a–e) durante la reacción de inactivación. Figura adaptada de Fromme et al., eLS (2020)

BlaC
Animación del proceso mencionado más arriba
La película original se puede obtener desde este enlace
adenine-riboswitch
Modelo estructural de la molécula de riboswitch rA71.
Arriba: Esquema del mecanismo de reacción de la adenina con el riboswitch rA71 mostrando todas las especies involucradas en la reacción.
Abajo: Modelos, con interacciones de enlace de hidrógeno, que muestran los residuos clave en los bolsillos de unión al ligando de apo1 (azul), apo2 (cian), IB (amarillo) y el estado de unión al ligando (rosa). Figura adaptada de Stagno et al., Nature (2017)
adenine-riboswitch
Los grandes cambios conformacionales inducidos por la adenina después de 10 minutos de mezcla, dan como resultado una transición de fase polimórfica y una conversión reticular de un grupo monoclínico (apo1 y apo2: azul y cian respectivamente) a un grupo espacial ortorrómbico (B/ade: magenta), que se acomodó en micro/nanocristales de rA71. Un subconjunto de 4 moléculas relacionadas por simetría (en color blanco) situadas entre las dos estructuras, ilustra que la mitad de las moléculas giran aproximadamente 90° tras la conversión. Figura de Stagno et al., FEBS J. (2017). El siguiente enlace permite observar la correspondiente película molecular.

Consideraciones para la realización de experimentos de cristalografía en serie (SFX)
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Preparación y caracterización de muestras cristalinas para SFX

Un experimento típico de SFX requiere muestras de cristales muy pequeños (nanocristales o microcristales), con alta densidad (109-1012 cristales/ml), y de tamaño muy homogéneo. Este tipo de muestras nunca se produce espontáneamente, por lo que normalmente se suelen utilizar disoluciones de precipitante comerciales para encontrar las condiciones adecuadas que produzcan muestras en forma de nano- o microcristales. Alternativamente, se puede partir de una condición en la que se hayan obtenido previamente cristales grandes, y posteriormente aplicar las modificaciones necesarias para producir los cristales de menor tamaño.

Muchos de los métodos clásicos existentes para producir cristales grandes (> 50 μm), con las modificaciones necesarias, podrían aplicarse para generar nanocristales o microcristales. Sin embargo, la densidad y homogeneidad de la muestra producida mediante estos métodos es insuficiente. En su lugar, se han desarrollado dos técnicas a partir de métodos ya existentes para producir grandes cantidades de muestras cristalinas con alta homogeneidad.
 

FID technique
Esquema de la configuración para experimentos de cristalización con FID (a,b) y FID con centrifugación (c).
(a) Configuración experimental en la que la solución de proteína se coloca cuidadosamente sobre la solución precipitante, donde solo se forman unos pocos nanocristales en la interfaz.
(b) En la configuración inversa, la solución precipitante se agrega gota a gota sobre la solución de proteína, lo que induce un aumento de la nucleación transitoria en la interfaz.
(c) Variante del experimento que se muestra en (b), en el que los núcleos formados en la solución de proteína se aceleran por centrifugación hacia la zona de la interfaz, donde crecen en forma de nano- o microcristales. Cuando alcanzan un tamaño específico, se sedimentan en la zona de precipitación, donde dejan de crecer. De este modo se pueden conseguir nanocristales o microcristales con una distribución de tamaño muy estrecha. Figura de  Kupitz et al., Phil. Trans. Royal Soc. (2014)



Taspase1 crystals
Ejemplo de un experimento de optimización de cristales grandes a microcristales. Cristales grandes (200-300 µm) de la proteína Taspasa1, generados en solución de citrato de sodio 0,1 M pH 4, MPD 10%, AmSO4 1 M, en relación 1:1 y concentración de proteína 10 mg/ml (imagen de la izquierda), se optimizaron para crecer microcristales (5-10 µm) mediante la técnica FID en citrato de sodio 0,1 M pH 4, MPD al 15%, AmSO4 1,4 M, relación 1:3 y concentración de proteína 20 mg/ml (imagen de la derecha).

Existe una variedad de técnicas que pueden usarse para caracterizar los nanocristales o microcristales que se usan en SFX. Cuando el tamaño de los cristales es del orden de un micrómetro, pueden identificarse mediante métodos convencionales tales como la microscopía de luz polarizada en combinación con la microscopía de fluorescencia UV. Sin embargo, cuando el tamaño de los cristales está en el rango submicrométrico, se requieren métodos alternativos. La técnica cuyo acrónimo es SONICC (Second Order of Non-linear Imaging of Chiral Crystals) es el procedimiento más adecuado para identificar cristales tan pequeños como 100 nm [Wampler et al., J.Am.Chem.Soc. (2008)]. SONICC se basa en la espectroscopía de generación de armónicos de segundo orden (second-order harmonic generation, SHG). Para comprobar la calidad del cristal, el método más fiable es la clásica difracción de rayos X en polvo, aunque la microscopía electrónica de transmisión (TEM) es otro método fiable [Stevenson et al., Phil.Trans.Soc.B (2014)]. La dispersión dinámica de luz (dynamic light scattering, DLS) se usa comúnmente en experimentos SFX para evaluar la distribución del tamaño de los nanocristales, la homogeneidad, así como para optimizar el tamaño de las semillas cristalinas que puedan ser usadas en experimentos de optimización de cristales por el método de sembrado [Schubert et al., J. Appl. Cryst. (2015)].

Para obtener más información sobre la preparación y caracterización de muestras para experimentos de SFX, se sugiere acudir a otras referencias [Beale et al., J. Appl. Cryst. (2019); Beale & Marsh, JoVE (2021); Kupitz et al., Phil. Trans. Royal Soc. (2014); Martin-Garcia et al., Arch.Biochem.& Biophys. (2016); Dorner et al., Cryst. Growth Des.(2016)].
 

Métodos de suministro de muestra
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En los primeros experimentos de SFX, el suministro de muestras microcristalinas a los pulsos del XFEL, se llevó a cabo utilizando el inyector denominado "Gas Dynamic Virtual Nozzle" (GDVN). [Weierstall et al., Rev.Sci. Instrum. (2012); DePonte et al., J.Phys.D:App.Phys. (2008)]. Sin embargo, a pesar de que GDVN se ha utilizado con éxito en muchos experimentos de SFX, tiene la gran limitación de requerir un alto consumo de muestra. Por ello, la tecnología dedicada a este aspecto ha mejorado mucho en los últimos años, especialmente con la aparición de nuevos métodos que necesitan mucha menor cantidad de muestra. A continuación, se ilustra una breve descripción de todos los dispositivos de inyección de muestra disponibles en la actualidad para realizar experimentos SFX.


GDVN device      GDVN
Izquierda: Esquema de un inyector GDVN (Gas Dynamic Virtual Nozzle). El GDVN se ensambla colocando un capilar interno más pequeño, dentro de un capilar externo más grande. Los cristales pasan a través del capilar interior mientras que el gas de enfoque pasa por el capilar exterior. De este modo, se produce un chorro micrométrico muy fino cuando el gas que fluye conjuntamente se encuentra con los cristales a la salida del inyector. Figura de DePonte et al., J.Phys.D:App.Phys. (2008)
Derecha. Animación de un inyector de líquido en acción. Propiedad de SLAC
 
Los inyectores GDVN tienen dos limitaciones importantes: problemas de obstrucción y alto consumo de muestra, que fueron posteriormente mitigadas por un dispositivo con una boquilla focalizada de doble flujo (Double Flow Focused Nozzle, DFFN) [Oberthuer et al., Sci.Rep.(2017)]. El dispositivo DFFN utiliza un líquido que fluye coaxialmente (típicamente un alcohol) para acelerar el flujo de la solución que contiene los cristales, los cuales son posteriormente acelerados por un gas envolvente. Otro tipo de inyectores de líquido enfocados por gas, son los inyectores de mezcla, que se utilizan para experimentos de resolución temporal. El más conocido es el inyector desarrollado por el grupo de Lois Pollack de la Universidad de Cornell (USA), que consiste en un mezclador de microfluidos de capilares de vidrio concéntricos unidos a un dispositivo GDVN convencional [Calvey et al., Struc.Dyn.(2016)].  


GDVN-Pollack
Esquema del inyector de mezcla desarrollado por el grupo de Pollack en la Universidad de Cornell. Las áreas negras indican regiones unidas por resina epoxi UV. Los espaciadores de centrado de poliimida se muestran en naranja. La línea de muestra interna en la GDVN puede tener un diámetro interno de 50 o 75 μm. La longitud del dispositivo desde la punta de la GDVN hasta las líneas de suministro es de aproximadamente 10 cm. Figura de Calvey et al., Struc.Dyn.(2016)


LCP injector
Esquema e imagen real del “inyector LCP” desarrollado por Uwe Weierstall en ASU. Las líneas de agua (azul) y gas (verde) pasan a través de la varilla de la boquilla desde la izquierda, el LCP (rojo) sale de la boquilla de la derecha. El agua empuja el émbolo hidráulico para impulsar el LCP a través de un capilar. Se utilizan dos bolas de teflón esféricas para proporcionar un buen ajuste. El gas que fluye conjuntamente es necesario para una adecuada y segura extrusión, así como para mantener el flujo coaxial. Figura adaptada de Weierstall et al., Nature Com.(2014)


LCP
Animación sobre el funcionamiento de un inyector viscoso en acción


Algunos métodos comunes de extrusión de alta viscosidad: Fase cúbica lipídica (Lipidic Cubic Phase, LCP), ácido hialurónico (grasa), agarosa, PEO.

Todos los dispositivos descritos anteriormente permiten la generación de gotitas activadas eléctrica o acústicamente, en un modo de gota por demanda, lo que es deseable para un mínimo desperdicio de muestra.

Esquema-inyector
Representación esquemática del segmento de generación del flujo de gotas en el chip y fuera del chip, en interfaz con el instrumento XFEL
Figura tomada de Echelmeier et al., Internat. Conf. Mini. Sys. Chem. & Life Sci. (2015)
Izquierda: Generación de gotas en el dispositivo de microfluidos PDMS
Centro: Transferencia de gotas de cristales en suspensión a un capilar de sílice
Derecha: El capilar de sílice se utiliza como parte interna del GDVN, inyectando una corriente líquida en la cámara XFEL


Esquema-piezoPiezoADE
Izquierda: Esquema del dispositivo piezoeléctrico de suministro de muestra. Figura tomada de Zhao et al., FEBS J. (2019)
Centro: Animación del funcionamiento del dispositivo piezoeléctrico. Credits by SLAC.
Derecha: Esquema del dispositivo ADE. En el sistema invertido, la gota se expulsa hacia abajo y desde una microplaca con pocillos múltiples. El sistema Echo modificado está configurado para expulsar gotas hacia arriba de una microplaca con pocillos múltiples. Los pulsos de rayos X llegan a la región de interacción al mismo tiempo que las gotas que contienen los cristales.


Fixed target devices
Algunos de los dispositivos de soprte sólido más utilizados
a) y d) figuras adaptadas de Cohen et al., PNAS (2014); b) adaptada de Murray et al., Acta Cryst.D (2015); c) adaptada de Mueller et al., Struc. Dyn.(2015)


Fixed target
Animación de cómo se lleva a cabo la recogida de datos de difracción desde una matriz sólida en los XFEL. Propiedad de SLAC

Para obtener más información sobre el proceso de suministro de muestra, se recomienda consultar las siguientes referencias: Zhao et al., FEBS J. (2019); Martiel et al., Acta Cryst.(2019); Echelmeier et al., Anal.& Bioanal.Chem.(2019).


Recogida y procesado de datos en SFX
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La alta frecuencia de pulsos de rayos X producida en los XFEL (120 Hz en LCLS; 1 MHz en LCLS-II; 1,1 MHz (4,5 MHz en un futuro) en EuXFEL; 60 Hz en SACLA y PAL-PAL-XFEL; y 100 Hz en SwissFEL) ha hecho necesario el desarrollo de nuevas tecnologías para que los detectores sean capaces de integrar todos los fotones que llegan durante el intervalo de unos pocos femtosegundos. Por lo tanto, los detectores de SFX deben tener una alta velocidad de lectura, una alta relación señal/ruido, así como un amplio rango dinámico.

El primer detector para SFX fue el detector CSPAD (Cornell-SLAC Pixel Array Detector), desarrollado por científicos de SLAC. Consiste en 64 módulos individuales de 194 x 185 píxeles cada uno. El CSPAD está construido en forma en mosaico, generando un detector de 2,3 megapíxeles, con velocidades de lectura que coinciden con una frecuencia de pulsos de 120 Hz. La distribución de paneles deja un orificio de tamaño ajustable en el centro del detector, lo que permite que el haz de rayos X XFEL golpee y dañe el detector. Desde entonces, se han desarrollado tres detectores más para los XFEL, basados en esta tecnología modular: el AGIPD en EuXFEL, el JUNGFRAU en SwissFEL, y el ePIX en SLAC.

 
Detectors
Izquierda: Detector CSPAD (foto de SLAC),
Centro: Detector AGIPD (foto de EuXFEL)
Derecha: Detector ePIX (foto de SLAC)

Tal como se mencionó anteriormente, en SFX, los datos se recogen a partir de imágenes de difracción producidos por cristales orientados aleatoriamente, que, junto con la alta velocidad de repetición de los XFEL, dan como resultado cientos de miles de patrones de difracción a la hora, generando así terabytes de datos. Por lo tanto, la recogida y procesamiento de datos en SFX no se puede realizar de manera eficiente usando los métodos convencionales de procesado de datos cristalográficos, lo cual plantea nuevos desafíos respecto a los datos que normalmente se recogen en los sincrotrones. Además, debido a que los datos de SFX contienen una combinación de imágenes producidas por la difracción de los cristales,, imágenes sin difracción producidas por las aguas madres, e imágenes con difracción múltiple producidas por la difracción procedente de más de un cristal, el análisis en tiempo real y la reducción de datos se ha convertido en una necesidad perentoria para poder averiguar de forma rápida la calidad de los datos y optimizar así la estrategia de medida.
 
 
Data analysis workflow

Flujo de trabajo típico para el análisis de datos SFX
 
Pasos y herramientas para el procesamiento de datos en SFX:
  1. Reducción de datos: Este es el primer paso en el procesado de datos SFX, también conocido como paso de preprocesamiento o "paso de limpieza". Durante este paso, se eliminan todos los patrones de difracción en blanco y las que contienen difracción múltiple. Además, se hace un calibrado del detector, se sustrae la intensidad de fondo, se identifican las reflexiones de Bragg (lo que se denomina "búsqueda de picos"), y se realizan una serie de estadísticas sobre los datos recogidos. Actualmente hay tres programas disponibles para la reducción de datos: CASS, Cheetah (ver también este enlace) y OM (antes OnDA).  

  2. Indexado e integración: Los patrones de difracción procedentes del paso anterior, desprovistos de su intensidad de fondo , son procesados mediante programas informáticos tales como CrystFEL (ver también este enlace) o cctbx.xfel (ver también este enlace). Dichos programas identifican los picos de Bragg, determinan los parámetros de la celdilla unidad, y la orientación de cada cristal, para luego realizar el indexado mediante algoritmos tales como MOSFLM, DIRAX y XDS, así como algoritmos de auto indexado nuevos y más eficientes desarrollados recientemente, entre los que se incluyen XGANDALF, ASDF y FELIX, y TakeTwo. Se han desarrollado dos nuevos programas, SPIND y EMC, para aquellos casos en los que los patrones de difracción sean escasos y de baja intensidad, es decir, que solo contengan algunas reflexiones de Bragg identificables. Finalmente, una vez que el patrón de difracción completo se ha indexado con éxito, las intensidades se fusionan e integran utilizando métodos de Monte Carlo.
En un futuro inmediato aparecerán nuevos desafíos informáticos que hagan frente a la mayor velocidad de pulsos (del orden de los megahercios) de los venideros XFEL (como el EuXFEL con una estructura  de pulsos de 100.000 imágenes/s, o el LCLS-II, con el objetivo de alcanzar hasta 1 millón de pulsos/s), los cuales van a generar un mayor volumen de datos de difracción, desde los actuales terabytes/hora hasta los petabytes/hora.
  


Cristalografía en serie con fuentes de luz sincrotrón
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Las ventajas que ofrece el método de la cristalografía en serie y las nuevas vías que ha abierto en la investigación dentro del campo de la estructura de proteínas, ha despertado el interés de la comunidad de biólogos estructurales hasta el punto que las instalaciones XFEL ya no pueden satisfacer toda esa demanda, siendo necesario buscar alternativas, y la solución a este problema son las fuentes de radiación de sincrotrón. Los sincrotrones de próxima generación, capaces de generar haces de luz de rayos X más potentes y de un tamaño por debajo de una micra, equipados con ópticas de enfoque de haz mucho más sofisticadas, y con detectores mucho rápidos, se han convertido en una alternativa real.

En la actualidad, en casi cada uno de los sincrotrones más potentes del mundo hay al menos una línea de luz dedicada, total o parcialmente, a la técnica de la cristalografía en serie. Ejemplos de líneas de luz actualmente en funcionamiento, o en construcción, son: 23-ID-D en el Advanced Photon Source (Chicago, EEUU), la línea 17-ID-2 en el National Synchrotron Light Source II (Nueva York, EEUU), la línea 12-1 en el Synchrotron Stanford Radiation Lightsource (Stanford, EEUU), la línea  I24 en el Diamond Light Source (Oxford, Reino Unido) (Horrell et al., JoVE, 2021), la línea ID29 en el ESRF (Grenoble, Francia), la línea MicroMAX en MAX IV (Lund, Suecia), la línea TREXX en PETRA III (Hamburgo, Alemania), y las líneas BL13-XALOC y BL06-XAIRA en ALBA (Barcelona, España).

La adaptación de la técnica de la cristalografía en serie en sincrotrones ha sido posible gracias a los avances recientes en la tecnología de suministro de muestra, en concreto con el desarrollo de nuevos dispositivos más eficientes, que reducen drásticamente el consumo de muestra. Los dispositivos más exitosos empleados hasta ahora son los inyectores de alta viscosidad, los dispositivos de soportes fijos, y los denominados dispositivos de "gota bajo demanda". Desde que en 2014 Gati y sus colaboradores realizaran los primeros experimentos de cristalografía en serie en un sincrotrón, el número de estudios de este tipo ha crecido de forma exponencial en los últimos años. Los experimentos con resolución temporal en escalas de tiempo de unos pocos cientos de milisegundos, ahora ya son posibles de realizar en sincrotrones. Sin embargo, las futuras actualizaciones de los sincrotrones actuales a fuentes de radiación de próxima generación, nos permitirán realizar experimentos de resolución temporal en el rango de microsegundos y, probablemente, en el rango de nanosegundos, lo cual es muy relevante para el estudio de la mayor parte de los procesos enzimáticos que ocurren en las células.

Para más información sobre la cristalografía en serie en sincrotrones se pueden consultar los siguientes artículos de revisión recientemente publicados [Martin-Garcia JM, Crystals (2021) 11, 521; Pearson and Mehrabi, Curr. Opin. Struct. Biol. (2020) 65, 168-174].
 


Fuentes compactas de rayos X pulsados
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La principal limitación de los XFEL es su accesibilidad, lo que genera un cuello de botella extremo para la investigación de vanguardia. Por lo tanto, con el objetivo principal de hacer que la ciencia XFEL sea más accesible, el profesor de física William Graves del Center for Applied Structural Discovery (CASD) de la Universidad Estatal de Arizona (Arizona State University, ASU) lidera un proyecto internacional para la construcción de dos fuentes compactas de radiación X: una fuente de luz de rayos X compacta (CXLS) y un láser de electrones libres de rayos X compacto (CXFEL). Gracias al uso de los avances más recientes en tecnologías de aceleradores y láser, los dos instrumentos tendrán alrededor de 10 m de largo y costarán alrededor de $25 millones cada uno, que es mucho menor que el presupuesto necesario, del orden de 1 billón de dólares, para la construcción de un XFEL de varios kilómetros de longitud.

El componente clave de las nuevas máquinas compactas, donde se producirán los rayos X, es la región de interacción, que se basa en el principio físico denominado “dispersión de Compton inversa" (Inverse Compton Scattering, ICS). Los grupos de electrones generados por un cañón, viajarán a través de un acelerador lineal de varios metros de longitud hasta la región de interacción, donde colisionarán con potentes pulsos láser de infrarrojos. Cuando  la colisión ocurre con una geometría casi frontal, se produce la conversión de fotones láser de baja energía en rayos X de alta energía, los cuales se dispersan y emergen en la misma dirección que los electrones.
 

Inverse Compton scattering
Dispersión de Compton inversa (Inverse Compton Scattering, ICS)

Bill Graves (2019) mostrando partes de la máquina CXLS (fuente original)

El primer instrumento que se está construyendo actualmente en ASU es el CXLS. Este instrumento será capaz de proporcionar 1.000 pulsos de luz de  rayos X por segundo, con una duración de pulso de 100 fs, un flujo promedio de 1 x 1011 fotones/s, un brillo máximo de 9 x 1018 fotones / (s .1% mm2mrad2), y un tamaño de haz de tan solo 3 μm. Otra ventaja del CXLS es que los rayos X se podrán sintonizar entre 2 y 40 keV en dos anchos de banda, 0,1% y 5%. Sin embargo, los rayos X aún no serán muy coherentes. El CXLS se encendió en febrero de 2021 para producir los primeros electrones. Se espera que los primeros rayos X se produzcan a primeros del 2022.
 
CXLS
Disposición de la fuente de luz de rayos X compacta (CXLS) en la Universidad Estatal de Arizona. Los grupos de electrones generados por el foto inyector son acelerados y comprimidos por los dispositivos linacs y chicanes de compresión, respectivamente. El punto de interacción, donde los electrones y el láser colisionan para producir los rayos X por el fenómeno ICS, está resaltado con un recuadro rojo. La longitud total desde el foto inyector hasta el punto de interacción del ICS es de unos 10 m. También se ilustran los componentes de la cabina experimental (configuración y diagnóstico del haz, cámara de muestras y detector).  Figura adaptada de Fromme et al. eLS (2020).
CXLS photos
Izquierda: Fotoinyector
Centro: Sección de un CXLS correspondiente al fotoinyector y a los linac 
Derecha: Linacs de 1 m de longitud
CXLS and Bill Graves
Bill Graves (2021) explicando aspectos de la fuente de luz de rayos X compacta (CXLS)
Ver también el vídeo de Bill Graves (2021) explicando el instrumento


En cuanto al CXFEL, todavía se encuentra en su fase de diseño y se convertirá en una realidad en unos 5 años. Este instrumento superará las propiedades del CXLS, con rayos X totalmente coherentes y la posibilidad de producir rayos X del orden de los sub-femtosegundos.
 

CXFEL brightness
Brillo máximo en función de la energía de los fotones del CXFEL en comparación con el de los láseres convencionales, las fuentes de sincrotrón y los láseres de electrones libres de rayos X (XFEL)


Introducción sobre la tecnología CXFEL (2019) (fuente original)
 

Las fuentes de luz compactas revolucionarán el campo, al poner la tecnología a disposición de muchos más científicos de todo el mundo y acelerarán la velocidad a la que descubrimos conocimientos para ayudar a resolver desafíos globales. A continuación, se muestra una lista de los principales impactos que podrían tener los CXLS:
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