El modelo estructural. Fiabilidad del modelo estructural
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Tal como se dice en el apartado anterior, un modelo que ha sido "validado" de acuerdo con los criterios descritos, es decir, que muestra:
es un modelo fiable. Sin embargo, el concepto de fiabilidad no es un parámetro totalmente cuantificable o expresable mediante un número. Por lo tanto, para interpretar un modelo estructural hasta sus últimas consecuencias hay que tener en cuenta que se trata de una representación simplificada, construida sobre una función de densidad electrónica:
 
Densidad electrónica en un punto de coordenadas x,y,z
 
sobre la cual se han posicionado unos átomos, y en la cual influyen una serie de condicionamientos (ver apartados de más abajo)...

Al margen del contenido de los apartados generales que se incluyen a continuación, el lector con cierta experiencia previa en estos temas debería también consultar el contenido de los comentarios incluidos en los siguientes artículos:
El lector aventajado y con especial interés en la cristalografía de macromoléculas debería consultar también los resultados publicados en Nature (2016) 530, 202-206. En dicho artículo se pone de manifiesto que, además de la difracción coherente (máximos de Bragg), los patrones de difracción pueden mostrar información adicional en forma de difracción continua, muy útil, entre otros, para aumentar el grado de resolución del modelo. Un breve resumen de dicho artículo puede encontrarlo a través de este enlace.



Resolución del modelo


Así, hay que tener en cuenta el efecto del nivel de resolución de dicha función. El valor que muestra
ρ(xyz) en cada punto de la celdilla es dependiente de una triple suma en la que intervienen todos los factores de estructura, es decir, todas las ondas dispersadas por los átomos contenidos en la celdilla elemental. Por lo tanto, y tal como se ha dicho indirectamente en los párrafos de más arriba (mediante la llamada sobredeterminación), el grado de observabilidad o disponibilidad de ese conjunto de ondas es un aspecto crucial para obtener un valor representativo y realista de la densidad electrónica en cada punto. El grado de precisión (nivel de resolución) de un mapa de densidad electrónica se define como el inverso de la distancia mínima que seríamos capaces de "ver" en dicho mapa, que es dependiente de la longitud de onda (λ) de la radiación X usada en el experimento y del ángulo máximo (θ) de detección. Este valor de distancia mínima "visible" (que sería el inverso del nivel de resolución) se deduce de la ley de Bragg:

Distancia mínima "visible" en un mapa de densidad electrónica:    λ / 2.sen θmax

y parece, pues, obvio que para obtener una gran resolución en un mapa (es decir, para ser capaces de "ver" distancias muy pequeñas, es decir, detalles de la estructura) necesitaremos usar una longitud de onda pequeña (numerador pequeño) y al mismo tiempo disponer de datos experimentales, es decir de ondas dispersadas (factores de estructura) observados a ángulos de difracción altos (denominador grande).

En los cristales sencillos o de baja complejidad estructural, el número de ondas (factores de estructura) disponibles en el patrón de difracción suele ser suficiente para llegar a obtener valores razonables de ρ(xyz), y llegar así a poder ver detalles estructurales a gran resolución (distancias mínimas del orden de 0.5 Angströms o menores) pero no suele ser así en el caso de las macromoléculas. Por este motivo, en todos los casos (y en especial en los cristales de macromoléculas) la "riqueza" en datos experimentales de los patrones de difracción es un aspecto crucial para poder llegar a ver los detalles más importantes de la estructura.


Izquierda: Resolución baja: 5.0 Angström
Derecha: Resolución media: 3.0 Angström


Resolución alta: 1.7 Angström
Diferentes niveles de detalle de una misma zona del mapa de densidad electrónica de una proteína, calculado con un número variable de datos experimentales (creciente hacia la derecha y de arriba a abajo). Por claridad, en las figuras a 5.0 y 3.0 A de ressolución se han indicado las uniones entre los átomos de carbono de las cadenas principales mediante líneas amarillas. Parece obvio que en el mapa a 5.0 A sería muy dificil averiguar la localización de las cadenas peptídicas. En el mapa a 3.0 A vemos con cierta claridad la localización de dichas cadenas. En el mapa a mayor resolución (1.7 A) vemos claramente la localización de dichas cadenas y además podemos ver también las cadenas laterales de los aminoácidos.
 

Construcción de un segmento peptídico

Ejemplo sobre la construcción de un segmento peptídico sobre la función de densidad electrónica obtenida con las amplitudes y fases de un patrón de difracción con resolución de 1.7 Angström.




Efecto de la resolución del mapa (cantidad de datos experimentales)

La película muestra la densidad electrónica de una macromolécula calculada en una determinada zona de la celdilla elemental, a medida que el límite de resolución se ajusta lentamente de 0.5 a 6.0 Å, es decir, a medida que se va eliminando la contribución de las reflexiones de mayor ángulo de Bragg. Se observa que las cadenas laterales son reconocibles prácticamente hasta una resolución de 3.5 Å. Para este cálculo las fases están perfectamente determinadas, e igualmente el factor de desacuerdo entre los patrones de difracción observado y calculado es mínimo (R = 0,0%). Animación tomada de EMBO Bioinformatics Course (enlace ya no funciona).



Precisión en las medidas de las intensidades

Del mismo modo, para evaluar el grado de fiabilidad de un modelo hay que tener en cuenta el efecto de la precisión de las medidas de las amplitudes de difracción (las medidas de las intensidades):


Efecto de las amplitudes de difracción (precisión en las medidas de intensidad)

La película muestra el efecto (casi imperceptible) de calcular un mapa de densidad electrónica con amplitudes (intensidades de de difracción) erróneas, es decir, muy mal medidas. Las imágenes de esta película representan el cambio gradual de las amplitudes (desde valores razonables de desacuerdo con las teóricas, R=10%, hasta valores aleatorios, R=75%). Es interesante darse cuenta de que si las fases son correctas (tal como es el caso) el mapa apenas cambia hasta llegar a valores de R=30% y que es todavía interpretable hasta valores próximos a R=50%. Animación tomada de EMBO Bioinformatics Course (enlace ya no funciona).



Bondad de las fases (ausencia de errores)

Por último, es necesario tener en cuenta que el parámetro que más influye en la fiabilidad de un modelo estructural es la bondad de las fases asignadas a las amplitudes de difracción, tal como demuestra la siguiente representación:



Efecto de las fases (precisión en las fases)

La película muestra el efecto del cálculo de un mapa de densidad electrónica con fases mal estimadas. La "figura de mérito" de las fases (el coseno del error de la fase) se muestra como "m".  Obsérvese la fuerte dependencia existente entre la bondad de las fases y la apariencia del mapa para poder reconocer la localización de los átomos. Animación tomada de EMBO Bioinformatics Course (enlace ya no funciona).


 
Pero volvamos al punto de partida...
   
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