La
cristalización es el proceso mediante el cual las
moléculas se ordenan de un modo natural formando un
retículo repetitivo que denominamos cristal. No es objeto de
estas páginas hacer una presentación exhaustiva
de las diferentes técnicas de cristalización que
se pueden encontrar en muchos libros de texto o en diferentes
páginas web, en donde el lector comprobará que el proceso de cristalización
puede abordarse
mediante diferentes técnicas, tales como el enfriamiento de
una
disolución concentrada, añadiendo paulatinamente
un
segundo disolvente con menor solubilidad que el primero,
evaporación lenta del disolvente, sublimación,
enfriamiento lento de un sólido fundido,
contradifusión
de solventes a través de geles, etc. Para
principiantes se recomienda leer el panfleto
preparado por la UNESCO para crecer cristales únicos.
En lo restante de este apartado nos detendremos brevemente en
algunas de las técnicas más extendidas que se
usan para obtener cristales de proteínas. En el
caso de las
proteínas el experimento de cristalización
comienza con
una
solución de proteína relativamente concentrada
(entre 2 y 50 mg/ml) a la que, de algún modo, se le
añade lentamente algún reactivo, con la
intención de reducir la solubilidad de la
proteína y generar una precipitación controlada
de la misma. Si posteriormente se fuerza un incremento paulatino de
concentración y se controlan las condiciones, normalmente se
generan diminutos núcleos cristalinos cuyo ulterior
crecimiento puede dar lugar a cristales de tamaño adecuado
para los experimentos de difracción (entre 0.1 y 0.5 mm).
Los diagramas superiores
muestran, genéricamente, las
diferentes zonas
de un sistema proteína-precipitante en función de
las concentraciones
de ambos componentes.
Las zonas de color amarillo (izquierda) y blanco (derecha) representas
las
condiciones en las que la proteína estaría
solubilizada. En la zona de color
azul la proteína dejaría de ser soluble y
aparecería como un
precipitado. Ambas zonas están separadas por otra (de color
rosa) en
donde existe una ligera sobresaturación, idónea
para la nucleación
y crecimiento cristalino.
Por lo tanto,
para maximizar la
posibilidad de éxito de un intento de
cristalización, es necesario
diseñar distintos experimentos, partiendo de diferentes
posiciones
iniciales, es decir, de diferentes concentraciones de
proteína y
precipitante (flechas de diferentes colores en el esquema de arriba a
la
derecha).
Una de las
metodologías más
comunes para estos
experimentos es la basada en la técnica de la gota
colgante...
Esquema de un pocillo de
cristalización con el
método de la gota colgante
El procedimiento consiste,
aproximadamente, en los siguientes aspectos:
- Se colocan unos pocos
microlitros (1-2 μl) de la
solución de
proteína en el centro de un cubre-objetos de vidrio
y se le añaden otros tantos microlitros de la
solución del precipitante contenido en un pocillo, al cual
previamente se le ha equilibrado su pH mediante un tampón.
- El cubre-objetos que
contiene a la gota de mezcla se le da la vuelta y
con él se tapa el pocillo mencionado. Este sistema cerrado
evolucionará por equilibrio de vapor, y como la mezcla de
proteína y precipitante en la gota está menos
concentrada que la solución de precipitante en el pocillo,
el agua de ésta se evaporará,
uniéndose a la
solución del pocillo. Como resultado de este proceso, la
concentración de la proteína y del precipitante
aumentarán lentamente en la gota, y si las condiciones son
las adecuadas,
se formarán cristales.
En muchas ocasiones se
utiliza también la técnica de gota
sentada...
Esquema mostrando las diferencias entre
gota colgante y gota sentada
(tomado
de doi:10.1007/s40828-018-0064-1)
En el mercado existen cajas que
contienen un número elevado
de
estos pocillos (24 o más), de tal modo que se puedan
etiquetar y
almacenar con facilidad para su ulterior observación a
través de una lupa-microscopio, tal como se muestra en las
figuras
de abajo. Véase también la web que ofrece la empresa
Hampton Research.
Izquierda: Caja de 24 pocillos para la
cristalización de proteínas con gota colgante
Derecha:
Caja de 24 pocillos para la
cristalización de proteínas con gota sentada
El lector interesado puede igualmente visitar este magnífico
resumen
sobre experimento de la cristalización de
proteínas...(en inglés). En caso de
problemas puede usar este enlace para
observar el vídeo (en inglés) que
también se ofrece desde dicha web.
Izquierda:
Si
las
condiciones son adecuadas, los
cristales crecen en la gota con la apariencia que se muestra en la
imagen superior, tomada a través de una lupa-microscopio
Derecha:
Como
ayuda en la preparación de las diferentes condiciones
de inicio, se han desarrollado robots de cristalización que
simplifican mucho el proceso manual para rellenar las cajas que
contienen las diferentes condiciones de
prueba, pudiéndose
llenar una caja de cristalización en segundos
La
animación de abajo muestra el proceso de
crecimiento de cristales de
lisozima (una
proteína muy estable) desde un medio acuoso. La
duración
del proceso, que en su pantalla es de escasos segundos, corresponde
aproximadamente a unos 30 minutos reales.
Este es un caso
relativamente
excepcional en lo que a la velocidad de crecimiento cristalino se
refiere, pues es muy rápido.
Con esta misma
enzima (lisozima),
el vídeo de abajo, producido por Bernhard Rupp, nos muestra
la
relación que existe entre una
rápida nucleación y la velocidad de crecimiento.
Cuanto
mayor es el número de núcleos formados, menor es
la velocidad de crecimiento, y por lo tanto menor será el
tamaño de los cristales obtenidos. Compárese el
tamaño (mucho menor) de los cristales que crecen en las
imágenes de abajo con los mostrados arriba.
Existen otras muchas
técnicas de cristalización
que se usan para las proteínas, tales como el de la gota
sentada (similar al de la gota colgante), botones de
diálisis, microbatch, así como otras
técnicas muy interesantes basadas en la difusión
en geles, incluso con acupuntura...
Igualmente, el lector interesado puede visitar las páginas
que, sobre
los fenómenos de cristalización en gotas, ofrece
Terese Bergfors de la Universidad de Uppsala, así como leer los
artículos que se recogen en este número
especial de Acta Crystallographica.
No podemos perder de vista la revolución que va a
significar
para el supuesto "cuello de botella" de la
cristalización (especialmente para las
proteínas),
la introducción de la técnica de
la nanocristalografía en la escala de los femtosegundos, con
tiempos de exposición de la difracción del orden
de los femtosegundos, irradiando nanocrystales con rayos X
obtenidos mediante técnicas de un laser de
electrones
libres (
véase
este artículo publicado en Nature (2011) 470, 73-77).
Pero, volvamos
al punto de partida...
Tabla de
contenido
